فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)
تعداد صفحات:113
پایان نامه کارشناسی ارشد
زیست شناسی (گرایش بافت شناسی و جنین شناسی)
فهرست مطالب:
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه 1
مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته 1
1-1 سلول¬های بنیادی جنینی 3
1-2 سلول¬های بنیادی بالغ 4
1-3 سلول¬های بنیادی مغز استخوان 5
1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول¬های بنیادی مزانشیمی 8
1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول¬های بنیادی مزانشیمی 8
1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول¬های بنیادی مزانشیمی 10
1-4 کاربرد درمانی سلول¬های بنیادی مزانشیمی 14
1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده¬های مربوط به آن¬ها 17
1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک 17
1-5-1-1 انواع فاکتور¬های نوروتروفیک 18
1-5-2 گیرنده¬های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی 20
1-5-2-1 ساختار گیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین 20
1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین 22
1-6 سلول¬های بنیادی عصبی 25
1-6-1 نوروسفر 25
1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی 31
1-7 ضرورت اهداف تحقیق 33
فصل دوم: مواد و روش¬ها 35
2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی 36
2-2 جداسازی و کشت سلول¬های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ 36
2-2-1 طرز تهیه محیط کشت -MEM 36
2-2-2 طرز تهیهPBS فاقد کلسیم و منیزیم (2/7 : PH) 37
2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA 37
2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول¬های بنیادی مغز استخوان 39
2-2-5 پاساژ سلولی 39
2-3 تأیید هویت سلولهای استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی 39
2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71 40
2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4% 41
2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد 41
2-3-1-3 ساخت سرم بز 10% 41
2-3-1-4 طرز تهیه PBS ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH) 42
2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول 42
2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز 43
2-4بررسی مارکر عصبی βIII-tubulin در سلولهای مزانشیمی مغز استخوان به روش ایمونوسیتوشیمی 44
2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر¬ها به روش ایمونوسیتوشیمی 45
2-6 بررسی مولکولی بیان ژن¬های اعضای خانواده نوروتروفین 46
2-6-1 استخراج RNA کل از سلولهای کشت شده 46
2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 48
2-6-3 الکتروفورز ژل آگارز 49
2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-) 52
2-6-5 انتخاب پرایمر 53
2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها 54
2-6-7 واکنش PCR 54
2-7 آنالیز آماری 58
فصل سوم: نتایج 59
3-1 مشاهده مورفولوژی سلولهای مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت 59
3-2 تعیین هویت سلولهای مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز 60
3-3 ویژگی¬های مورفولوژیکی سلولهای مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت 60
3-4 تأیید هویت سلولهای عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی 60
3-5 تأیید هویت نوروسفر¬ها با استفاده از نشانگر نستین 61
3-6 ارزیابی بیان ژن¬های فاکتورهای نوروتروفیک و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند¬ها و نمودار¬های مربوط به آن 61
4-1 نتیجه¬گیری و بحث 70
4-1 مورفولوژی سلول¬های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن¬ها 71
4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول¬های بنیادی مزانشیمی 72
4-3 پتانسیل تمایز سلول¬های بنیادی مغز استخوان به سلول¬های عصبی 74
4-4 تولید نوروسفر از سلول¬های بنیادی مغز استخوان در کشت طولانی مدت 76
4-5 نتیجه گیری 77
پیشنهادات 77
مراجع 79
فهرست شکل¬ها
شکل 1-1. مسیرهای پیام رسانی که با واسطه P75NTR تنظیم می¬شود.. 22
شکل 1-2. نوروتروفین¬ها و گیرنده¬های مربوط با آن:رسپتور تیروزین کیناز و P75NTR. 23
شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trk تنظیم می¬شود. 24
شکل 1-4. سلول¬های بنیادی عصبی و رده¬های سلولی مربوط به آن.. 25
شکل 1-5 .ارزیابی شکل¬گیری نوروسفر 26
شکل 1. تصاویر فاز کنتراست سلول¬های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی در محیط کشت در پاساژهای مختلف. 62
شکل 2. شناسایی سلول¬های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی 63
شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته 64
شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم MSCs پس از هفته سوم 65
شکل4 تأیید هویت سلولهای عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی 66
شکل 5 تأیید هویت نوروسفر¬ها با استفاده از نشانگر نستین 66
شکل6 A.الگوی بیان ژن¬ فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلول¬های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و B: گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67
شکل 6. C الگوی بیان ژن پیش¬ساز عصبی و ژن¬های اختصاصی سلول¬های دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلول¬های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67
نمودار 6 A. مقایسه میزان بیان نسبی ژن¬های فاکتور¬های نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.. 68
نمودار6 B.مقایسه میزان بیان نسبی ژن¬های نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69
فهرست جدول ها
جدول1-1 . اسامی گوناگون سلول¬های بنیادی مزانشیمی 6
جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرایمرها، F : پرایمر بالادست ، R : پرایمر پایین‌دست 57
هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که آیا MSCs بعد از کشت طولانی مدت میتوانند به طورخودبخودی به سلولهای پیشساز عصبی تمایز یابند.
مواد وروشها: این تحقیق شامل دو گروه میباشد: کشت پاساژ پنجم MSCs در محیط کشت -MEMα و FBS %10 به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیرهای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژنهای فاکتورهای نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژنهای نورونی (Nestin،TH وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin به منظور تعیین سلولهایی که این نشانگرها را بیان میکنند استفاده شد.
نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلولهای شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت میدهند. بعد از هفته دوم کشت، سلولهای شبه نورونی به نشانگر βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسیهای آماری نشان داده است که MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنیداری از ژنهای فاکتورهای نوروتروفیک NGF و GDNFو ژنهای نورونی Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند .(p<0.05)
نتیجه گیری: در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا میکنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القاکننده خاص همراه شوند و قادرند ژنهای اختصاصی نورونهای دوپامینرژیک مانند THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان میدهد که MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلولهای نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد میشود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماریهای نورولوژیکی باشند.
کلید واژگان: سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان،کشت طولانی مدت، تمایز خودبخودی، نوروسفر
پایان نامه تولید نوروسفر از سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان