مشخصات این فایل
عنوان: ساخت محلول ها
فرمت فایل : word( قابل ویرایش)
تعداد صفحات : 47
این مقاله درمورد ساخت محلول ها می باشد .
بخشی از تیترها به همراه مختصری از توضیحات هر تیتر از مقاله ساخت محلول ها
- محلولهای رنگامیزی ژل پلی آکریل آمید:
1-3- محلول رنگامیزی کوماسی بلو G-250:
حجم ml50 محلول رنگامیزی با مخلوط کردن اجزاء زیر تهیه گردید:
ml15 متانل و ml10 اسید استیک گلاسیال با ml25آب مقطر مخلوط شد. به محلول حاصل مقدار g2/0-1/0 رنگ کوماسی بلو G-250 اضافه گردید تا محلول آبی تیره رنگی بدست آمد. این محلول بعنوان محلول ثبوت پروتئینها نیز عمل می کند.
1-1-3- محلول رنگبر:
برای زدودن رنگ از ژل ، به حجم بیشتری محلول رنگبر نسبت به محلول رنگامیزی نیاز است . حجم ml100از این محلول برای رنگبری یک ژل کوچک با ضخامت mm75/0 کافی می باشد. برای تهیة آن ml30 متانل و ml20 اسید استیک با ml50 آب مقطر مخلوط شد و در ظرف درب بسته ای نگهداری گردید.
2-3- محلولهای رنگامیزی نقره :
این محلولها شامل چهارمحلول ، به ترتیب جهت رنگامیزی بکار برده شدند. هر یک از محلولهای رنگامیزی به حجم ml60 تهیه شد که جهت رنگامیزی یک ژل کوچک با ضخامت mm75/0 کافی می باشد. تمامی محلولها برای هر بار رنگامیزی ، تازه تهیه شده و پس از استفاده دور ریخته شدند.
1-2-3- معرف ثبوت:
حجم ml60 محلول استوک استن 50% (V/V) (ml30 استن در ml30 آب مقطر) با حجم ml5/1 محلول استوک تری کلرواستیک اسید (TCA) 50% (V/V) (ml 75/0TCA در ml75/0 آب مقطر ) مخلوط شد. سپس 25 میکرولیتر محلول فرمالدتید 37% اضافه شد.
2-2-3- محلول پیش تیمار II :
حجم 100 میکرولیتر محلول استوک تیوسولفات سدیم 10% (W/V) (g 1/0 تیوسولفات سدیم خشک در 1ml آب مقطر ) با ml60 آب مقطر مخلوط گشت.
3-2-3- معرف رنگ:
حجم ml8/0 محلول استوک نیترات نقره 20% (W/V) (g2/0نیترات نقره خشک در ml1 آب مقطره ) و حجم ml6/0 محلول فرمالدئید 37% به ml60 آب مقطر اضافه شده و مخلوط گردید.
4-2-3- معرف ظهور
مقدار g2/1 کربنات سدیم وزن شده و در ml60 آب مقطر حل شد. سپس 25 میکرولیتر محلول فرمالائید 37% و 25 میکرولیتر محلول استوک تیوسولفات سدیم 10% (W/V) (g1/0 تیوسولفات سدیم خشک در ml1 آب مقطر) به محلول فوق اضافه و مخلوط گشت. .....(ادامه دارد)
روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون سفادکس G-200:
1-7-4- پر کردن ستون ژل فیلتراسیون سفادکس G-200:
ستون شیشه ای به ابعاد cm6/1×100 با استفاده از پایه و گیره به حالت عمودی قرار گرفت. این ستون دارای فیلتر در انتهای تحتانی خود بوده و نیازی به پشم شیشه ندارد. لوله متصل به انتهای ستون ،بسته شده و با کمک یک میلة شیشه ای ،ابتدا به ارتفاع cm20 بافر C و بلافاصله ژل سفادکس G-200 آماده شده ،تا پر شدن کامل ستون ، وارد آن شد. سپس ستون به مدت 2 ساعت به حالت سکون باقی ماند تا ژل به آرامی در انتهای آن متراکم گردید. پس از این مدت ،انتهای ستون باز شده و بافر ابتدا به آرامی (با بالا بردن سطح خروج بافر ) و به تدریج با سرعت جریان بیشتر از ستون خارج گشت. با پائین رفتن سطح ژل ، آنقدر ژل اضافه شد تا ستون از ژل فشرده شده پر شد. در این مرحله ، ستون به مدت دو روز توسط بافر C شسته شد تا علاوه بر فشردگی کامل ژل ، با بافر مذکور به تعادل رسید.
2-7-4- کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون :
مقدار mg 1 رنگ دکستران بلو در ml1 بافر C در حمام آب گرم حل شد. محلول آبی بدست آمده به مدت 3 دقیقه با دور rpm13000 میکروفیوژ شد. پمپ مکنده به لوله پلاستیکی انتهای ستون متصل شد و شدت مکش آن طوری تنظیم شد تا سرعت جریان بافر به ml/h3/5 رسید. محلول بدون رسوب دکستران بلو بر روی ستون برده شد. بلافاصله پس از اتمام رنگ ، ستون به مدت 3 ساعت توسط بافر C با غلظت mM100 نمک Nacl شسشته شد تا رنگ آبی (نشانه ) به ارتفاع فوقانی طول ستون رسید. نمونه خشک شده با روش لیوفیلیزاسیون ،در حداکثر .....(ادامه دارد)ml2
PAGE در سیستم بافری ناپیوسته :
PAGE در اغلب موارد در سیستم بافری ناپیوسته (چندقسمتی ) انجام می گیرد. در سیستم بافری ناپیوسته، بر خلاف سیستم بافری پیوسته ، ترکیب یونی و pH بافر در نمونه ، ژل و مخازن با یکدیگر تفاوت دارد. در این سیستم ژل شامل دو قسمت ژل فوقانی و ژل تحتانی است. این دو قسمت علاوه بر بافر ، از نظر اندازه منافذ ژل نیز متفاوت هستند.
مزیت سیستم بافری ناپیوسته در این است که کارایی الکتروفورز آنچنان متأثر از حجم نمونه نیست. در این سیستم میتوان حجم های بالایی از نمونه های رقیق پروتئین را بطور مطلوب به اجزای آن تفکیک نمود. دلیل آن این است که پروتئینها در طی حرکت در ژل فوقانی (ژل متراکم کننده ) به صورت لایه های بسیار نازکی درمی آیند و سپس در ژل تحتانی (ژل جداکننده) به اجزائ خود تفکیک میشوند.
این سیستم به سه نوع مختلف ، با pH بالا ، pH پائین و pH خنثی انجام میشود. سیستم بافری .....(ادامه دارد)
اثرات نمک بر روی حلالیت پروتئین ها:
در محلولهای آبی ، پروتئینها همچون مولکولهای دیگر، با پیوندهای کم و بیش قوی مولکولهای آب ، در یک ساختار منظم احاطه می شوند، آب بدلیل ثابت دی الکتریک بالا ،یک حلال عمومی برای پروتئینها محسوب می شود و چنین کمیتی با افزودن یونهایی همچون غلظتهای پائین Nacl به آب افزایش می یابد. (شکل 3) از این رو غلظت و نوع یونها بواسطة تغییر در ساختار و خواص آب ، بر روی حلالیت پروتئینها تأثیر می گذارد. این اثرات اغلب با مراجعه به یونهای (Lyotrop Series) Hofmeister Series توضیح داده میشود.
اولین یونهای هر سری ، ساختار آب را می گسلد و حلالیت پروتئینها را کاهش می دهد (Salting out effect) ولی یونهای آخر معمولاً حلالیت مولکولهای غیر قطبی را افزایش می دهند (Salting in effect) این بدان معنی است که نمکهای مختلف ، با اثر ترکیبی آنیونها و کاتیونهای این سری ، بر روی حلالیت پروتئینها اثر می گذارند. (7)
1-1-2- جزء بندی پروتئینها با نمک آمونیوم سولفات :
عصارة خام حاصل از مرحله استخراج پروتئین ها ، به منظور کاربرد مستقیم بر روی ستونهای کروماتوگرافی مناسب نیست . بنابراین ، روشی لازم است تا علاوه بر آنکه عصاره را تغلیظ کند، بیشترین حجم پروتئینها را نیز برداشت نماید. نمک آمونیوم سولفات معمولترین نمک بکار رفته جهت رسوبدهی جزئی پروتئینها می باشد. این نمک با افزایش اثر آب گریزی در محلول ، موجب تجمع پروتئینها از طریق سطوح هیدروفوبیک و در نتیجه رسوب آنها می گردد.
در این روش، ابتدا پروتئینهای حجیم با یکدیگر رسوب می کنند و به این ترتیب بخشی از پروتئینهای اضافی حذف می شوند. سپس در مرحلة بعد رسوبگیری ، پروتئین مورد نظر می تواند از مادر آب بدست آمده ، رسوبگیری شود.
همانگونه که در (شکل 5) نشان داده شده است ، غلظت نمک آمونیوم سولفات مورد نیاز برای رسوبدهی ، بصورت درصد اشباع بیان میشود که وابسته به دماست. .....(ادامه دارد)
بخشی از فهرست مطالب مقاله ساخت محلول ها
ساخت محلولها :
1- محلولهای بافری:
2- محلولهای االکتروفورز:
2-1- محلول بافر B:
3-1- محلول بافر C:
1-2- محلول بافر تانک یا الکترود:
2-2-محلول بافر ژل متراکم کننده (ژل فوقانی):
3-2- محلول بافر ژل جدا کننده (ژل تحتانی):
4-2- محلول بافر نمونه (× 5):
6-2- محلول آمونیوم پرسولفات (APS):
1-3- محلول رنگامیزی کوماسی بلو G-250:
2-3- محلولهای رنگامیزی نقره :
دانلود مقاله ساخت محلول ها