لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت
تعداد صفحات: 14
آزمایش میکروسکوپی نمونه های مدفوع
معمولاً آزمایش میکروسکوپی نمونه های مدفوع متشکل از سه مرحله جداگانه شامل :
تهیه گسترش مستقیم 2- روشهای تغلیظ نمونه 3- روشهای رنگ آمیزی دائمی می باشد
الف- تهیه گسترش مستقیم(مرطوب)
گسترش مستقیم را می توان در کوتاهترین مدت و با حداقل امکانات تهیه نمود.
در صورت مثبت بودن آنها از نظر وجود انگل، می توان یک گزارش اولیه سریع به پزشک ارائه داد و گزارش نهائی را موکول به انجام آزمایش با استفاده از روشهای تغلیظ و رنگ آمیزی دائمی نمود.
در آزمایش مستقیم به علت برداشت حجم بسیار کمی از مدفوع، امکان دستیابی به انگل خیلی کم است. همچنین در صورت یافتن انگل، به علت اینکه بعضی از تک یاخته ها خیلی کوچک می باشند به سختی می توان در گسترش مستقیم نوع آنها را تعیین نمود.
اهداف تهیه گسترش مستقیم شامل:
ارزیابی میزان آلودگی بیمار 2- تشخیص سریع نمونه هایی که آلودگی شدید دارند3- بررسی حرکت ارگانیسم می باشد.
این روش آماده سازی باید بر روی نمونه های تازه مدفوع که در یخچال نگهداری نشده و یا با مواد نگهدارنده مخلوط نگردیده است، انجام گیرد. در این روش، مراحل مختلف زندگی اغلب انگلهای روده ای (تروفوزوئیت، کیست، لارو و تخم) ، اووسیست کوکسیدیاها ، اجسام کروماتوئید موجود درکیست و حرکت تروفوزوئیت ها را می توان تشخیص داد.
در مورد نمونه های تازه ای که در ماده نگهدارنده قرار داده نشده اند، محلول 85/0 % کلرورسدیم در آب و یا محلول ید به عنوان رقیق کننده استفاده می شود. برای نمونه های نگهداری شده در فرمالین و یا مواد نگهدارنده دیگر، مواد نگهدارنده نقش رقیق کننده را نیز ایفا می کنند.
باید توجه نمود که ید و مواد نگهدارنده مانند فرمالین باعث کشته شدن ارگانیسم شده و حرکت آن را نمی توان بررسی نمود.
تهیه گسترش مستقیم با محلول ید باعث می شود که هسته و بیشتر عناصر داخل کیستهای انگل مشخص گردند. معمولاً در این گونه آماده سازی، تروفوزوئیت ها شکل طبیعی خود را از دست می دهند. تخم کرمها و لاروها قابل شناسایی هستند اما بعضاً جزئیات داخلی آنها نامشخص می شود.
برای تشخیص اولیه اووسیست کریپتوسپوریدیوم تهیه نمونه با محلول ید پیشنهاد می گردد، زیرا معمولاً اووسیستها ید را جذب نکرده و شفاف می مانند (برخلاف مخمرها و دیگر عناصر مدفوع که رنگ زرد ید را جذب می نمایند) اما به هر حال باید تشخیص قطعی کریپتوسپوریدیوم با رنگ آمیزهای اختصاصی و یا استفاده از کیت دارای آنتی بادی منوکلونال اختصاصی انجام گیرد.
اووسیست ایزوسپورابلی نیز می تواند در گسترش مستقیم دیده شود. اسپورهای میکروسپوریدیا آنقدر کوچک هستند که ممکن است با ذره های کوچک موجود در محیط اشتباه شوند، بنابراین معمولاًدر گسترش مستقیم تشخیص صحیح داده نمی شوند.
در امتحان میکروسکوپی نمونه مدفوع ممکن است عناصر زیر دیده شوند:
تروفوزوئیت و کیست تک یاخته های روده ای
اووسیست کوکسیدیا و اسپورهای میکروسپوریدیا که تشخیص این اسپورها از ذره های کوچک موجود در محیط مشکل است .
تخم کرمها و لاروها
گلبولهای قرمز که ممکن است دلیل زخم یا عوامل دیگر خونریزی دهنده باشد.
گلبولهای سفید مخصوصاً نوتروفیلها که ممکن است دلیل التهاب باشد.
ائوزینوفیلها که معمولاً دلیل وجود یک پاسخ ایمنی است(که ممکن است در ارتباط با وجود عفونتهای انگلی و یا علل دیگر باشد).
ماکروفاژها که ممکن است به دلیل حضور عفونتهای باکتریایی یا انگلی باشد.
کریستالهای شارکوت لیدن که بقایای ائوزینوفیلهای تخریب شده است (ممکن است به دلیل وجود عفونتهای انگلی و یا علل دیگر باشد).
قارچها (انواع کاندیدا) و مخمرهای دیگر و یا قارچهای شبه مخمر .
سلولهای گیاهی، دانه های گرده و اسپورهای قارچها که ممکن است شبیه تخم کرمها، کیست تک یاخته ها و اووسیست کوکسیدیا و یا اسپورهای میکروسپوریدیا باشد.
فیبریا ریشه گیاهان و یا موی حیوانات که ممکن است شبیه لارو کرمها باشد.
تهیه محلول سرم فیزیولوژی:
85% گرم کلرورسدیم(Nacl) را در 100 میلی لیتر آب مقطر به خوبی حل کنید.
به میزان 10 میلی لیتر به داخل 10 لوله در پیچ دار بریزید. لوله ها را در دمای c 121 بمدت 15 دقیقه اتوکلاو نمائید و بعد از سرد شدن در یخچال 4 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.(در صورت در دسترس نبودن لوله در پیچ دار پس از استریل نمودن می توان، جهت جلوگیری از تبخیر محلول در لوله را با پارافیلم کاملاً ببندید) روی برچسب نام محلول و تاریخ انقضاء آن را به مدت حداکثر یک سال بعد از تاریخ ساخت بنویسید.
تهیه محلول D'Anton's iodine
مواد لازم:
یدور پتاسیم (Potassium iodide= Kl) 1 گرم
کریستال ید پودر شده (lodine crystals) 5/1 گرم
آب مقطر تا 100 میلی لیتر
یدورپتاسیم و کریستالهای ید را در آب مقطر حل کنید. (مقدار اضافی کریستالهای حل نشده ید در ته ظرف باقی می ماند که به دلیل وجود این کریستالها ، محلول ذخیره در مدت زمان طولانی، دارای کیفیت مطلوب می باشدبنابراین محلول را صاف ننمایید.
محلول فوق رادرشیشه قهوه ای رنگ ریخته ودر محل تاریک، در حرارت اطاق نگهداری نمایید. این محلول جهت استفاده فوری به کار می رود، بنابراین مقداری از آن را به عنوان محلول کاری در دسترس قرار دهید. رنگ محلول کاری باید شبیه چای پر رنگ باشد و چنانچه در مدت 14-10 روز رنگ آن روشن تر گردد، دور ریخته شود.
روی برچسب شیشه محتوی محلول ذخیره، نام محلول و تاریخ انقضای آن را به مدت حداکثر یک سال بعد از تاریخ ساخت بنویسید.
تهیه محلول Lugol's iodine))
مواد لازم:
یدور پتاسیم 10 گرم
کریستال ید پودر نشده 5 گرم
آب مقطر تا 100 میلی لیتر
(مراحل اشاره شده در مورد تهیه محلول ید و این محلول مشابه است)
جهت ساخت محلول کاری از محلول ذخیره به نسبت 5 :1 آن را با آب مقطر رقیق نموده و داخل شیشه قهوه ای رنگ (قطره چکان) نگهداری می نمائیم .
تهیه رنگ متیلن بلوی بافره (گسترش مستقیم)
Nair's Buffered Methylene blue stain (Direct smear)
این روش آماده سازی گسترش مستقیم جهت مشخص نمودن جزئیات هسته تروفوزوئیتها و افتراق آنها از ماکروفاژها بکار می رود، بویژه زمانی که از محلول با PH پائین استفاده شود که سبب نفوذ هرچه بیشتر رنگ به داخل ارگانیسم می گردد.
بعد از 5 تا 10 دقیقه سیتوپلاسم به رنگ آبی کمرنگ و هسته به رنگ آبی بسیار پر رنگ دیده می شود. گسترشها باید در مدت 30 دقیقه مورد بررسی قرار گیرند.
روش کار
تهیه محلول ذخیرهA
55/11 میلی لیتر از اسید استیک Acetis Acid (CH3COOH) را با آب مقطر به حجم 1000 میلی لیتر می رسانیم.
تهیه محلول ذخیره B
4/16 گرم استات سدیم بدون آب (NaC2H3O2) ویا 2/27 گرم استات سدیم با 3 مولکول آب
(NaC2H3O2,3H2O) را درآب مقطر حل نموده وحجم نهایی را به 100 میلی لیتر می رسانیم.
طبق جدول زیر محلول BوA را مخلوط نموده و با آب مقطر به حجم 100 میلی لیتر می رسانیم :
محلول ذخیره B محلول ذخیره A
(میلی لیتر)
(میلی لیتر)
PH
7/3
3/46
6/3
6
44
8/3
9
41
4
2/13
8/36
2/4
5/19
5/30
4/4
5/24
5/25
6/4
06/0 گرم (60 میلی گرم ) پودر متیلن بلو را به 100 میلی لیتر از محلول بافر اضافه کرده و کاملاً حل مینمائیم. معمولاً استفاده از بافر استات 6/3 = PH بهترین نتیجه را ایجاد می کند.
روش انجام آزمایش مستقیم
یک قطره سرم فیزیولوژی 85/0% رادر طرف چپ و یک قطره از محلول لوگل را در طرف راست لام قرار می دهیم.
مقدار خیلی کمی از مدفوع (به اندازه 2 میلی گرم و یا در حدی که نوک یک اپلیکاتور را به داخل نمونه فرو کنیم) را در سرم فیزیولوژی به حالت یکنواخت در می آوریم.اگر بیشتر از این مقدار برداشته شود،گسترش رقیق شده و احتمال مشاهده انگل کم می شود.
عمل فوق را بوسیله اپلیکاتور دیگری با محلول لوگل انجام می دهیم.می توان یک قطره از محلول متیلن بلوی بافره را نیز بر روی لام دیگری قرار داد و به طریقه فوق نمونه مدفوع را در آن به حالت یکنواخت در آورد.
جهت بررسی نمونه های فوق یک لامل(mm) 22*22 بر روی نمونه تهیه شده قرار می دهیم .
ترجیحاً می توان نمونه های تهیه شده در سرم فیزیولوژی و ید را بر روی لامهای جداگانه ای قرار داد که در این صورت امکان جاری شدن مایع بر روی میکروسکوپ کاهش می یابد.
مقاله درباره آزمایش میکروسکوپی نمونه های مدفوع (2)
